ЮНИТЕКА:

Анализ спермы:

Преимущества автоматического анализа спермы с помощью анализатора SQA-V

По мировой статистике примерно 15% супружеских пар обращаются за медицинской помощью в связи с проблемой бесплодия (1). В среднем, у 20% бесплодных пар выявляется мужской фактор бесплодия, в 40% случаев причиной бесплодия является сочетание мужского и женского факторов. Таким образом, мужской фактор присутствует примерно у 60% бесплодных пар (2). Пара определяется как имеющая мужской фактор бесплодия, если на протяжении более 1 года не происходит зачатия, и мужчина имеет патологический анализ спермы и/или патологию сексуальной функции.

Учитывая высокую вероятность наличия мужского фактора бесплодия, а также сложность и высокую стоимость обследования женщины, обследование бесплодной пары целесообразно начинать с обследования мужского партнера. Обследование мужчины включает медицинский анамнез, физикальное исследование, лабораторные тесты и анализ спермы.

В большинстве клиник анализ спермы традиционно проводится путем микроскопического исследования. Подсчитывается количество сперматозоидов, определяется их подвижность и морфология. Однако на результаты микроскопической оценки подвижности оказывают существенное влияние: температура, вид счетной камеры, статистические ошибки и субъективные факторы (3). Оценка морфологии зависит от техники фиксации и окрашивания мазков, качества микроскопа, статистических ошибок и уровня подготовки специалиста, проводящего анализ (4).

Все эти факторы делают микроскопический метод высоко вариабельным, что указано в отчетах по выполнению программ контроля качества мануального анализа спермы (5, 6, 7). Кроме того, микроскопический метод трудно поддается стандартизации, трудоемок и утомителен, требует специального обучения и опыта.

Поэтому в последние годы в клинику активно внедряются приборы, позволяющие автоматизировать анализ спермы. В настоящей работе мы провели сравнительное исследование основных показателей качества спермы параллельно двумя методами: традиционным микроскопическим методом и с использованием автоматического компьютеризированного анализатора качества спермы SQA-V, а также определили воспроизводимость результатов автоматического анализа спермы.

 

Описание анализатора SQA-V

SQA-V представляет собой прибор, основанный на электрооптических и компьютерных технологиях, сочетающихся с гибкостью и удобством системы визуализации. Это автоматическое устройство, разработанное для быстрого, объективного и воспроизводимого исследования качества спермы.

Пробы вводятся в специальный имеющий две независимые измерительные кюветы капилляр, который затем вставлялся в электрооптическую камеру анализатора SQA-V. В ней два прецизионных пучка света проходит через пробу и попадает на фотодетекторы, которые преобразовывают меняющиеся световые потоки в электрические сигналы. 

Подвижные и неподвижные сперматозоиды влияют на потоки света в соответствии с присущими им свойствами. Изменения световых потоков и соответствующих световых сигналов детектируются и передаются на встроенный компьютер, который их анализирует с помощью специальных алгоритмов. Отчет анализа спермы выдается в стандартизированной форме по требованиям ВОЗ.

Система визуализации является автономной и работает независимо от остальных блоков анализатора. Рациональная комбинация визуализации с автоматической компьютеризированной системой используется как дополнительный инструмент для просмотра атипичных случаев, идентификации специфической патологии и возможности визуального определения морфологии сперматозоидов. Видеосистема предназначена для прямого просмотра видеоизображения со стандартного слайда или капилляра с пробой, при увеличении в 300 – 500 раз.

Анализатор SQA-V имеет архив, встроенный принтер для распечатки отчета анализа, а также разъемы для передачи архива и изображения на внешний компьютер. Это позволяет архивировать большие базы данных, передавать информацию из периферической клиники в андрологический центр, а также для обновлять программное обеспечение прибора.

Анализ спермы

Пробы спермы были получены от 77-ми пациентов, обратившихся в андрологическое отделение при Медицинском центре Tel-Hashomer, в соответствии с инструкциями ВОЗ (8). После полного разжижжения пробы спермы параллельно двумя методами: под микроскопом и на анализаторе SQA-V были исследованы следующие показатели: концентрация сперматозоидов, % подвижности, % поступательной подвижности и % сперматозоидов с нормальной морфологией.

Некоторые из проб анализировали после процедуры отмывки с добавления Earle’sbuffer. Микроскопическое исследование проб спермы проводилось двумя независимыми лаборантами, прошедшими квалификационный тест (UKNEQAS).

Протокол сравнения

Подготовка материала для анализа включала полное разжижение и тщательное перемешивание непосредственно перед забором проб. Капилляр SQA-V заполнялся пробами спермы в соответствии с прилагаемой инструкцией. Тестирование на анализаторе SQA-V проводилось в соответствии с руководством по эксплуатации прибора и указаниями на экране. В случае проб спермы очень низкого качества дополнительные визуальные данные были получены с помощью видеосистемы прибора.

Параллельно с анализатором все пробы были исследованы под фазово-контрастным микроскопом. Концентрация сперматозоидов определялась в счетной камере Маклера, процент подвижности – на стандартном слайде, оценка морфологии сперматозоидов выполнялась после окрашивания мазков спермы методом Папаниколау (8).

В двух параллельных препаратах подсчитывали минимум 200 сперматозоидов для определения показателей спермы. Сперматозоиды были классифицированы на предмет нормальных и патологических форм с использованием критериев ВОЗ (8). После классификации морфологии сперматозоидов был рассчитан процент сперматозоидов с нормальной морфологией.

Статистический анализ

Статистический анализ результатов, полученных на анализаторе SQA-V и при микроскопическом анализе спермы, был проведен с использованием регрессионного анализа Passing и Bablok, разработанного для сравнения двух различных методов (9,10). Кроме этого, была определена воспроизводимость SQA-V.

 

Сравнение параметров спермы с помощью регрессионного анализа Passing и Bablok

На основании полученных результатов был построены регрессионные графики сравнения концентрации сперматозоидов, процента подвижности спермы и процента поступательно подвижных сперматозоидов определенные на анализаторе SQA-V и микроскопически (Рис. 1-3, табл.1).

Рисунок 1. Концентрация сперматозоидов в свежих и отмытых пробах, определенная на SQA-V и микроскопически.

Рисунок 2. Процент подвижности сперматозоидов в свежих и отмытых пробах, определенный SQA- V и микроскопически.

 Рисунок 3. Процент поступательной подвижности сперматозоидов в свежих и отмытых пробах, определенный SQA-V и микроскопически.

 

Таблица 1. Регрессионный анализ Passing и Bablok результатов анализа спермы с помощью автоматического анализатора SQA-V и микроскопически.

 
Параметры
Метод
Среднее значение

Наклон регрессион-ного графика

Концентрация сперматозоидов

SQA-V
46,6
0.99
Микроскоп
48,4
Процент подвижности
SQA-V
35,2
1,07
Микроскоп
33,6

Процент поступательной подвижности

SQA-V
30,2
1,08
Микроскоп
27,6
 

В результате статистического анализа результатов выявлено, что:

1)      Средние значения результатов концентрации сперматозоидов, процента подвижности спермы и процента поступательно подвижных сперматозоидов, полученных двумя методами достаточно близки (Табл. 1). Этот факт свидетельствует об отсутствии систематических сдвигов результатов одного метода относительно другого.

2)      Наклон всех графиков регрессии близок к единице (Табл.1, Рис 1-3), что является показателем отсутствия систематических сдвигов результатов двух методов во всем исследованном диапазоне. Поэтому, результаты определения концентрации сперматозоидов, процента подвижности спермы и процента поступательно подвижных сперматозоидов, полученные на анализаторе спермы SQA-V и при микроскопическом исследовании можно считать хорошо сопоставимыми.

Однако, при сравнении результатов анализа отдельных проб был выявлен существенный разброс данных, полученных двумя методами исследования. В качестве примера приведем 5 проб, в которых при анализе на SQA-V обнаружено порядка 20 миллионов сперматозоидов в мл (М/мл) (Рис. 1). При подсчете под микроскопом в этих же образцах было выявлено: в первом образце - около 10 М/мл, во втором и третьем порядка 20 М/мл, в четвертом – 28 М/мл и в пятом – 32 М/мл. Таким образом, разброс результатов индивидуальных проб достигал 50% и более. Еще более серьезный разброс результатов двух методов отмечен для определения процента подвижных (Рис. 2) и прогрессивно подвижных сперматозоидов (Рис. 3).

Таким образом, очевидно, что, несмотря на хорошее совпадение средних значений, случайный разброс единичных значений высок. Для ответа на вопрос, что является причиной существенного разброса результатов двух методов мы провели определение воспроизводимости результатов автоматического анализа спермы на SQA-V.

Воспроизводимость результатов анализа спермы с использованием прибора SQA-V

Воспроизводимость измерений SQA-V была рассчитана как коэффициент вариации по формуле: CV = стандартное отклонение / среднее x 100% в трипликатах измерений с использованием одного и того же капилляра, содержащего одну и ту же пробу спермы.

Были оценены три наиболее важных традиционныхпараметра спермы: концентрация, процент подвижности и процент нормальной морфологии. Полученные результаты представлены на Рис. 4 - 6. 

Рисунок 4. Воспроизводимость измерений концентрации спермы в свежих и отмытых пробах с использованием прибора SQA-V.

 

Рисунок 5. Воспроизводимость измерений % подвижности в свежих и отмытых пробах спермы с использованием прибора SQA-V.

Рисунок 6. Воспроизводимость измерений % нормальной морфологии в свежих и отмытых пробах спермы с использованием прибора SQA-V.

Коэффициент вариации концентрации сперматозоидов и подвижности в большинстве случаев был ниже 6%, показателя нормальной морфологии - ниже 3%. Полученные данные свидетельствуют о высокой воспроизводимости показателей автоматического анализа спермы.

Таким образом, поскольку коэффициент вариации результатов анализа на приборе SQA-V, был не более 6%, а расхождения результатов автоматического и мануального методов анализа зачастую превышали 50%, очевидно, что причина различий в результатах двух методов кроется в высокой вариабельности результатов микроскопического исследования.

Причин, обуславливающих высокую вариабельность данных микроскопического анализа – несколько. Абсолютная величина ошибки при мануальном исследовании состоит из нескольких составляющих и может варьировать в очень широких пределах, как правило, превышая 30%, а, в ряде случаев, достигая и 100%. Первая, неизбежная составляющая погрешности - статистическая ошибка, обусловленная случайными вариациями числа клеток, попадающих в площадь сетки счетной камеры, при подсчете 200 клеток составляет +/- 7% (одно стандартное отклонение). Эта статистическая ошибка соответствует разбросу получаемых значений в +/- 14% (два стандартных отклонения или 95% доверительный интервал). Отметим, что это минимальное значение статистической ошибки, характерное для проведения анализа в максимально комфортных условиях (в частности при подсчете неподвижных объектов). Что же касается образцов спермы, то здесь врачу КЛД приходится анализировать совокупность достаточно быстро движущихся объектов (причем, с различной скоростью и по различным траекториям!). Вторая составляющая - субъективный фактор. Показано, что определение наиболее важных параметров (подвижность, морфология), производимое одновременно несколькими врачами, лабораториями, либо одним врачом при многократном повторном анализе, имеют значительный разброс, даже при использовании одного протокола и однотипного оборудования (5,6,7). Причем расхождения в результатах особенно велики при исследовании подвижности и морфологии сперматозоидов, что обусловлено отсутствием в протоколах четких критериев оценки подвижности и морфологии (они достаточно расплывчаты, например, термины «быстрое», «медленное» движение применительно к подвижности, либо «овальная», «большая» - в описании морфологии головки сперматозоида и т.п.), что разрешает различную трактовку и субъективизм в оценках. Сложность введения объективных критериев метрологической оценки обусловлена особенностями человеческого восприятия. Во-вторых, несмотря на существование единого протокола сложно стандартизовать такую процедуру, как, например, подсчет подвижности, когда в одном поле зрения находится большое количество объектов. О какой объективности анализа может идти речь, если врачу скажем при концентрации сперматозоидов 50 М/мл, необходимо анализировать порядка 30-40 движущихся объектов одновременно? В этом случае, в зависимости от концентрации внимания врача на одной из категорий сперматозоидов возможно завышение этой категории (погрешность эта возрастает при повышении концентрации клеток или повышении их подвижности). В третьих, сами протоколы допускают различные варианты использования лабораторной техники (например, в протоколе ВОЗ предлагается использовать на выбор несколько типов счетных камер, несколько вариантов способов окраски сперматозоидов), что, несмотря на примерную однотипность, вносит дополнительные погрешности. Нельзя не учитывать тот факт, что высокая погрешность исследования не только влечет за собой постановку ошибочного диагноза, но и может оказать серьезное воздействие на психику пациента.

Исходя из вышесказанногопри диагностике мужского бесплодия, и особенно при мониторинге лечения пациентов, актуальной является задача повышения точности и объективности исследования эякулята. По целому ряду описанных выше причин, решение этой задачи с использованием традиционного микроскопического метода невозможно. Таким образом, на сегодняшний день единственным способом повышения точности и объективности исследования качества спермы является автоматизация.

В данной работе показано, что использование анализатора качества спермы SQA-V для проведения исследования эякулята позволяет полностью исключить основную составляющую погрешности анализа – влияние субъективного фактора и гарантирует получение высокостабильных результатов анализов.

 

Литература

  1. Howards S.S. (1995) Treatment of male infertility. New Eng. J. Med. 332, 312-317.
  2. Farley T.M.M. (1987) The WHO standardized investigation of the infertile couple. In Ratnam S.S., Reoh E.S., Anandakumar C. (eds), Infertility male and female. Proceedings of the 12th World Congress on Fertility and Sterility. Parthenon Publishing Group, Carnforth, Lancs, UK, pp.123-125. 
  3. Yeung C.H., Cooper T.G. and Nieschlag E. (1997) A technique for standardization and quality control of subjective sperm motility assessments in semen analysis. Fertil. Steril., 67,1156-1158.
  4. Martine zC., Mar C., Azcarate M., Pascual P., Aritzeta J.M., and Lopez-Urrutia A.(2000) Sperm motility index: a quick screening parameter from SQA-IIB to rule out oligospermia and asthenozoospermia in male fertility study. Hum. Reprod., 15, 1727-1733.
  5. Cooper T.G., Atkinson A.D., and Nieschlag E.(1999) Experience with external quality control in spermatology. Hum. Reprod., 14, 765-769.
  6. Dunphy B.C., Kay R., Barratt C.L., Cooke I.D. (1989) Quality control during the conventional analysis of semen, an essential exercise. J. Androl., 10, 378-385.
  7. Cooper T.G., Neuwinger J., Bahrs S., and Nieschlag E. (1992) Internal quality control of semen analysis. Fertil. Steril., 58, 172-178.
  8. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Fourth edition, 1999.
  9. Passing H, Bablok W. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in Clinical Chemistry, Part I. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:709-720.
  10. Solnica B, Naskalski JW. Quality control of SMBG in clinical practice. Scand J Clin Lab Invest Suppl 2005; 240:80-5.
Теги: