Вакуумные пробирки UNIVAC для гематологических исследований с К₂ЭДТА

*Продажа товаров осуществляется только Юридическим Лицам

Ассортимент вакуумных пробирок UNIVAC® с К₂ЭДТА:

 

 

Информация о наполнителях и особенности преаналитического этапа при гематологических исследованиях

Вакуумные пробирки с калиевыми солями ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) используются для взятия крови с целью выполнения гематологических исследований (анализ клеточного состава крови), гликозилированного гемоглобина, иммунологического исследования методом проточной цитометрии, исследований методом полимеразной цепной реакции.

ЭДТА надежно блокирует процессы свертывания крови, связывая ионизированный кальций и при этом, в отличие от других антикоагулянтов (в частности, гепарина лития или цитрата натрия) не вызывает структурных изменений клеточных элементов.

В гематологии в основном используют вакуумные пробирки, содержащие двукалиевую (К₂ЭДТА) и трикалиевую (К₃ЭДТА) соли ЭДТА.

Поскольку, для выполнения исследования образца крови в гематологии требуются совсем небольшие объемы крови (в частности, для выполнения автоматизированного анализа крови необходимо всего от 10 до 300 мкл),  рационально применение вакуумных пробирок для взятия венозной крови с объемом не более 2-3 мл и размером 13x75 мм.

Концентрация ЭДТА в пробе крови

Концентрации К₂ЭДТА и К₃ЭДТА в образце взятой крови должна составлять от 4,1 до 6,8 ммоль/л крови (от 1,2 до 2,0 мг/мл крови).

Для выполнения этого требования, во-первых, надо использовать пробирки надлежащего качества, во-вторых, необходимо строго соблюдать объем взятой крови, который должен соответствовать указанной на пробирке отметке. Пробирку следует извлекать из держателя только после того, как пробирка наполнилась и кровь прекратила в нее поступать. В обязательном порядке необходимо проверить соответствие уровня заполнения пробирки метке номинального объема. Допустимо не более 10% отклонения от объема наполнения пробирки (например, при общем объеме заполнения пробирки 5 мл отклонение в объеме может составить 0,5 мл).

Недостаток антикоагулянта приводит к свертыванию крови и образованию микросгустков, что может являться причиной занижения количества клеток при автоматическом подсчете, а также засорения магистралей гематологического анализатора и нарушению работы прибора.

Избыточная концентрация антикоагулянта, обусловленная недостаточным заполнением пробирки, как правило, ведет к сморщиванию эритроцитов вследствие повышения осмотического давления и искажению таких клинических показателей, как гематокрит (HCT), средний объем эритроцитов (MCV), средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (MCH)  и т.д.

ВАЖНО! Для того, чтобы все молекулы Са²⁺, содержащиеся в пробе крови были оперативно связны, необходимо обеспечить максимально полное взаимодействие К₂ЭДТА (К₃ЭДТА) с пробой крови. Поэтому сразу после взятия крови в вакуумную пробирку с ЭДТА ее необходимо тщательно перемешать, плавно переворачивая 8–10 раз. Последствия недостаточно тщательного перемешивания проб крови с антикоагулянтом всегда необратимы. Пробы вследствие образования сгустка не подлежат исследованию. А микросгустки, которые не видны невооруженным глазом, как уже было сказано выше - причина недостоверных результатов анализа и риск выхода из строя автоанализатора.

Выполнение анализа крови на гематологическом анализаторе. Что обязательно следует учитывать?

1. Время выполнения гематологического исследования после взятия крови

Международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) рекомендует проводить гематологические исследования на автоматических анализаторах через 40–60 мин после взятия венозной крови. Это связано с образованием обратимых тромбоцитарных агрегатов в пробе при их контактной активации в первые 30 мин и соответствующим влиянием на результаты подсчета форменных элементов крови.

2. Необходимость тщательного перемешивания пробы перед выполнением исследования

Недостаточно тщательное перемешивание крови перед выполнением исследования цельной крови на гематологическом анализаторе является одним из наиболее серьезных источников погрешности! Дело в том, что после того, как цельную кровь, забранную в пробирку с антикоагулянтом, ставят в штатив, начинается неумолимый отсчет времени и запускается процесс седиментации клеток. Это явление всем очень хорошо известно, так как на нем основано определение СОЭ. Уже в первые минуты стояния образца крови эритроциты продолжают беспорядочно перемещаться и агрегируют. Практически мгновенно они формируют «монетные столбики» (Рис. 1 и Рис. 2).

Рисунок 1.  Агрегация эритроцитов.  Электронная микрофотография  «монетных столбиков» (сканирующий микроскоп).

Рисунок 2.  Агрегация эритроцитов.  В формировании молекулярных связей между поверхностью отдельных эритроцитов участвуют фибриноген и глобулины.

Эритроцитарные агрегаты вначале имеют небольшие размеры - спустя 4 мин после того, как кровь поместили в пробирку, состоят примерно из 10‑ти эритроцитов. Далее они постепенно становятся крупнее и разветвляются. Число эритроцитов в таких агрегатах достигает пятидесяти и более. Удельный вес агрегатов эритроцитов достаточно большой, поэтому они  перемещаются в нижнюю часть пробирки, вытесняя значительно более легкие лейкоциты и тромбоциты в верхнюю часть пробы.  Таким образом, при хранении пробирок с несвернувшейся кровью в вертикальном положении лейкоциты и тромбоциты скапливаются в виде белого слоя на границе раздела между осевшими эритроцитами и плазмой, образуя так называемую, лейкоцитарно-тромбоцитарную пленку.

Каждый сотрудник КДЛ, работающий с цельной кровью, знает, насколько непросто выполнить качественное перемешивание образца после того, как пробирка с кровью постояла более получаса. Резко встряхивать пробирку категорически нельзя, поскольку это приведет к гемолизу части эритроцитов! А поскольку плавные движения, из-за высокой вязкости цельной крови – не очень эффективны, чтобы качественно перемешать кровь, требуется медленно переворачивать пробирку не менее 8–10 раз! При большом количестве проб это достаточно трудоемко, поэтому лучше для этих целей использовать специализированный гематологический миксер.

Насколько серьезно на результат автоматического анализа может повлиять эффект седиментации клеток при недостаточном перемешивании пробы крови продемонстрируем на практических примерах. Исследования проводились на базе ООО «Эйлитон» с использованием вакуумных пробирок UNIVAC^® с К₂ЭДТА (13 х 75, объем 5 мл).

На первом этапе провели пятикратное измерение образца венозной крови пациента на автоматическом гематологическом анализаторе непосредственно после венепункции. После взятия крови содержимое пробирки тщательно перемешали, плавно переворачивая пробирку 8–10 раз. Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты измерения гематологических показателей на гематологическом анализаторе непосредственно после взятия крови

SD - среднее квадратическое отклонение,

CV - коэффициент вариации,

В - границы достоверности, рассчитанные по формуле: B = X ±1.96SD.

Как видно из таблицы, при качественном перемешивании пробы после взятия крови и перед выполнением исследования результаты автоматического анализа высоко воспроизводимы.

Для моделирования эффекта седиментации по 400 мкл крови переносили в 8 микропробирок. Микропробирки помещали в штатив и хранили при комнатной температуре. Через определенные интервалы времени (1, 5, 10 и 20 минут) забирали по 2 пробирки для измерения основных гематологических показателей. Забор крови осуществляли со дна микропробирки (Рисунок 3), т.к. в верхней части очень быстро происходило расслаивание и результаты измерения в большей степени определялись положением иглы пробоотборника, поэтому были невоспроизводимыми.

Рисунок 3. Положение иглы пробозаборника гематологического анализатора при исследовании эффекта седиментации.

Полученные результаты представлены в Таблице 2 и на Рисунках 4, 5.

Таблица 2. Влияние эффекта седиментации форменных элементов на результаты анализа.

Из представленной таблицы следует, что стояние образца крови в течение 1 минуты существенно не влияет на результат измерения. А уже, начиная с 5 минуты после взятия крови, регистрируются выраженные явления седиментации эритроцитов, которые увеличиваются с течением времени. Причем, как видно из  таблицы, с увеличением времени хранения крови in vitro на дне пробирки  увеличивается  только концентрация эритроцитов и, естественно, гемоглобина, т.е. осаждаются как агрегаты эритроцитов, так и единичные эритроциты - как наиболее «тяжелые» из форменных элементов крови. Что же касается более «легких» клеток – тромбоцитов и лейкоцитов, то их концентрация, наоборот, со временем резко снижается, то есть, основная часть этих клеток  переходит в верхний слой образца. Особенно наглядно это видно на рисунках 4 и 5.

Рисунок 4. Влияние эффекта седиментации на результаты автоматического определения концентрации эритроцитов и лейкоцитов.

Рисунок 5. Влияние эффекта седиментации на результаты автоматического определения концентрации тромбоцитов.

На следующем этапе работы изучалась возможность предотвращения седиментации с  использованием гематологического миксера. С этой целью проводили измерения гематологических показателей образца крови через каждые 5 минут в течение 2-часов. Всего проведено 20 измерений. Между измерениями  пробирка постоянно находилась на миксере. Венозную кровь, как и в предыдущем случае, забирали в вакуумную пробирку UNIVAC^® с К₂ЭДТА (13х75, объем 5 мл) пробирку (13х75мм). Первое измерение производили непосредственно после взятия крови. Полученные результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Исследование эффекта предотвращения седиментации форменных элементов крови с использованием гематологического миксера.

SD - среднее квадратическое отклонение,

В - границы достоверности, рассчитанные по формуле:

B = X±1.96SD.

Рисунок 6. Предотвращение эффекта седиментации эритроцитов с использованием гематологического миксера.

Рисунок 7. Динамика концентрации лейкоцитов при постоянном перемешивании пробы на гематологическом миксере. 

Рисунок 8. Динамика концентрации тромбоцитов при постоянном перемешивании пробы на гематологическом миксере.

Как видно из Таблицы 3 и Рисунков 6-8, полученные результаты анализа образцов крови, помещенных на миксер непосредственно после забора крови, не выявили каких-либо признаков седиментации.

Таким образом, во избежание влияния эффекта седиментации на результат автоматизированного анализа крови, крайне важно тщательно перемешивать пробы перед выполнением исследования. Это можно делать с использованием гематологического миксера или плавно переворачивая пробирку 8–10 раз вручную.

Хранение проб крови

Во многих отечественных и зарубежных руководствах по клинической лабораторной диагностике указывается, что для автоматического подсчета концентрации клеток крови допустимо хранение проб крови в течение 24 часов при температуре +2 –8°С. В то же время следует учитывать, что низкие температуры могут приводить к изменениям в структуре и функции клеточных мембран и повышению вероятности разрушения клеток.

Транспортировка проб крови

Транспортировка и хранение проб производится при постоянной температуре 20–22^оС в специальных термоконтейнерах, которые имеют амортизационные гнезда для пробирок. При высокой температуре внешней среды закрытый термоконтейнер помещают в термосумку с хладоэлементом, при низких температурах – в термосумку. Оптимальное время транспортировки проб 1–2 ч, допустимое – до 4 ч.

К₂ЭДТА или К₃ЭДТА? Какой антикоагулянт предпочтительнее?

До сих пор нет единого мнения по данному вопросу.

Международный комитет по стандартизации в гематологии (ICSH) рекомендует К₂ЭДТА в качестве антикоагулянта выбора при взятии крови для гематологических исследований.

Однако в исследованиях, проведенных по данной тематике различными группами авторов, либо были получены достаточно противоречивые результаты, или не было выявлено принципиальных различий в результатах анализов крови пациентов, взятой в пробирки с К₂ЭДТА и К₃ЭДТА.

Таким образом, можно сделать вывод, что при проведении гематологических исследований корректно использовать, как двукалиевую (К₂ЭДТА), так и трикалиевую (К₃ЭДТА) соли ЭДТА.

Список литературы:

1. Goossens W, Van Duppen V, Verwilghen K₂- or K₃-EDTA: the anticoagulant of choice in routine haematology? Clin Lab Haematol. 1991;13(3):291-5.

2. 1. ICSH guidelines for the evaluation of blood cell analysers including those used for differential leucocyte and reticulocyte counting INTERNATIONAL COUNCIL FOR STANDARDIZATION IN HAEMATOLOGY. Int. Jnl. Lab. Hem. 2014, 36, 613–627

3. 2. Lippi, G., Betsou, F., Cadamuro, J., Cornes, M., Fleischhacker, M., Fruekilde, P., Neumaier, M., Nybo, M., Padoan, A., Plebani, M., Sciacovelli, L., Vermeersch, P., von Meyer, A., Simundic, A., & on behalf of the Working Group for Preanalytical Phase (WG-PRE), European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM). (2019). Preanalytical challenges – time for solutions, Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 57(7), 974-981.

4. 3. V. Wiwanitkit Effect of EDTA K₂ and K₃ anticoagulants on the complete blood count measured by hematological analyzer November 2011Archives of Hellenic Medicine28(6):131-132.

5. 4. Алан Г. Б. Клиническое руководство Тица по лабораторным тестам //М.: Лабора. – 2013. – Т. 1280.

6. 5. Егорова М.О., Сапенко Т.П., Патругина Н.В. Преаналитический этап лабораторных исследований в практике медицинских сестер. Венозная кровь. Справочник зав КДЛ № 2 февраль 2017. С. 33–40.

7. 6. Крюкова В. А. Актуальные вопросы преаналитического этапа гематологических исследований. Справочник зав КДЛ № 8 август 2007. С. 21-44.