Набор для количественного определения содержания глюкозы в сыворотке и плазме крови человека глюкозооксидазным методом "ГЛЮКОЗА-UTS"

Принцип метода.

В состав рабочего реагента для определения глюкозы фотометрическим биохимическим методом входят: глюкозооксидаза, пероксидаза, 4-аминоантипирин и фенол. В качестве буфера используется ТРИС (2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол).

В основе метода лежат последовательность двух реакций.

Первая реакция обеспечивает высокую селективность метода (глюкозооксидаза катализирует реакцию окисления только D-глюкозы, никакие другие молекулы моносахаридов в эту реакцию не вступают!)

Глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярном количестве перекись водорода.

Вторая реакция индикаторная: перекись водорода под действием пероксидазы в реакции с 4-аминоантипирин и фенолом образует окрашенный продукт – хинонимин, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце.

Спектр поглощения продукта реакции хинонимина и холостой пробы представлен на Рисунке 1.

Рис. 1. Спектры поглощения продукта реакции хинонимина и холостой пробы (данные, получены в ООО «Эйлитон» с использованием набора реагентов для количественного определения содержания глюкозы в сыворотке и плазме крови человека глюкозооксидазным методом "ГЛЮКОЗА-UTS"). Концентрация калибратора 5,55 ммоль/л.

Как видно из графика, максимум поглощения хинонимина расположен в диапазоне 480 – 530 нм и в этом диапазоне регистрируется максимальная разница в величине светопоглощения продукта реакции и холостой пробы. Поэтому для фотометрических измерений реакционной смеси выбирается длина волны 480-530 нм. Желательно выбирать длину волны максимально близкую к максимуму поглощения 505 нм (основная длина волны). Использование двухволнового фотометрирования (дифференциальная длина волны в диапазоне 600-630 нм) позволяет исключить влияние на результат анализа гемолиза, хилеза и иктеричности сыворотки, а также дефектов на стенках фотометрической кюветы [8].

На Рисунке 2 представлена кинетика колориметрической реакции при 37,0^оС.

Рис. 2. Кинетика колориметрической реакции при 37,0°С (данные, получены в ООО «Эйлитон» с использованием набора реагентов для количественного определения содержания глюкозы в сыворотке и плазме крови человека глюкозооксидазным методом "ГЛЮКОЗА-UTS").

Как видно из графика, светопоглощение продукта реакции по истечении 10 минут от начала добавления пробы к реагенту при 37,0°С выходит на плато и далее меняется незначительно. Таким образом, для оценки уровня концентрации глюкозы в сыворотке/плазме крови фотометрирование можно проводить через 10 минут после постановки реакции.

Требования к образцу

После взятия образца крови необходимо максимально быстро отделить плазму или сыворотку от форменных элементов крови [3]. Это очень важно, поскольку концентрация глюкозы при хранении образца крови ex vivo очень быстро снижается в связи ее потреблением клетками крови.

Эритроцит является метаболически активной клеткой и содержит более 40 различных ферментов. Энергетическое обеспечение эритроцита осуществляется за счет утилизации глюкозы в реакциях гликолиза. В результате гликолиза при комнатной температуре фосфорилируется около 5-7% глюкозы крови в час при концентрациях, близких к референсному интервалу, что в абсолютных величинах соответствует изменению концентрации на 0,3 – 0,4 ммоль/л. Более высокая скорость потери глюкозы будет иметь место при повышенной температуре окружающей среды и в образцах с высоким содержанием лейкоцитов [11, 13]. 

Снижение концентрации глюкозы при хранении пробы крови перед исследованием может стать причиной пропуска случаев диабета у большого числа пациентов с концентрациями глюкозы, близкими к значениям «сut-off».

Снизить степень влияния гликолиза на результат анализа можно, используя для взятия крови пробирки с фторидом натрия или йодоацетатом лития. Фторид натрия (2,5 мг/мл крови) и йодоацетат лития (0,5 мг/мл крови) ингибируют енолазу (фосфопируватгидратазу) – один из ферментов гликолитического пути [10].

Но надо учитывать тот факт, что в первый час после взятия образца крови даже использование фторида и йодоацетата не может предотвратить снижение концентрации глюкозы, связанное с процессами гликолиза! В экспериментальных исследованиях было показано, что уровни снижения концентрации глюкозы в первый час после взятия образца крови в пробирки с фторидом и без него практически идентичны [12].

Это обусловлено тем, что енолаза участвует в девятом, предпоследнем этапе гликолиза. Она катализирует переход 2-фосфо-D-глицериновой кислоты в фосфоенолпируват (Рис.3). 

Рис.3. Схема гликолиза.

Таким образом, несмотря на то, что присутствующий в пробе крови фторид, быстро блокирует енолазу (в течение <5 минут), ферменты перед енолазой в гликолитическом пути остаются активными. Поэтому глюкоза продолжает метаболизироваться в эритроцитах до глюкозо-6-фосфата, который далее метаболизируется до других фосфорилированных метаболитов, приводя к занижению определяемой концентрации глюкозы в плазме/сыворотке крови. 

Скорость фосфорилирования глюкозы до глюкозо-6-фосфата зависит от поступления АТФ. Как видно из схемы гликолиза (Рис.3), до восьмого этапа в реакциях гликолиза сохранялся нулевой баланс АТФ (на первом и третьем этапе расходовалось 2 молекулы АТФ, на седьмом этапе образовывалось 2 молекулы АТФ). На десятом этапе в результате превращения фосфоенолпирувата в пируват образуется 2 молекулы АТФ. Таким образом, блокирование фторидом натрия процесса гликолиза на 9 этапе, предотвращает синтез новых молекул АТФ, и зависимые от концентрации АТФ реакции 1 и 3 стадии гликолиза останавливаются. Экспериментально было показано, что через 60 мин после добавления фторида синтез АТФ в эритроцитах снижается почти на 90%. Это отражается на динамике снижения концентрации глюкозы в цельной крови - в течение последующих 3 часов концентрация глюкозы в крови в присутствии фторида натрия снижается уже незначительно и с 4-х до 72-х часов остается стабильной [9].

Поэтому для получения корректных результатов концентрации глюкозы в плазме/сыворотке крови важно обеспечивать быстрое отделение сгустка. Это наиболее эффективно минимизирует потери глюкозы, связанные с ее утилизацией эритроцитами.

Для стабилизации глюкозы в плазме крови используются вакуумные пробирки со следующими наполнителями:

• фторид натрия и оксалат калия;

• йодоацетат и лития гепарин;

• фторид натрия и ЭДТА.

Вакуумные пробирки с этими наполнителями кодируются серой крышкой.

В качестве антикоагулянтов можно использовать гепарин, оксалат калия или ЭДТА. Основное действие гепарина — усиливает активность антитромбина, блокирующего активность тромбина и, следовательно, торможение перехода растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин. Механизм действия оксалата калия схож с ЭДТА (связывание кальция).

После взятия пробы пробирки следует перемешать, переворачивая 6–8 раз. Пробирки с фторидом/оксалатом необходимо перемешивать с особой осторожностью во избежание гемолиза.

Центрифугирование следует производить при 1 300 g в течение 10 мин [6].

Полученную после центрифугирования сыворотку/плазму можно хранить – 24 часа при комнатной температуре и 72 часа при + 4^oС [1].

Глюкоза (от греч. glykys-сладкий) - моносахарид сладкого вкуса, молекулярная масса 180,16.

Рис. 4. Химическая формула и структура молекулы глюкозы.

Глюкоза является одним из важнейших источником энергии в организме.

В результате полного расщепления одной молекулы глюкозы образуется 36 молекул АТФ.

Суммарная реакция расщепления глюкозы до углекислого газа и воды (по анаэробному и аэробному пути) выглядит следующим образом:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ + 2АТФ → 6СО₂ + 6Н₂О + 38АТФ + Qт,

где Qт — тепловая энергия.

Основным источниками глюкозы для организма являются углеводы, поступающие с пищей. Часть глюкозы поступает в кровь из печени.

Обмен глюкозы в организме

После ферментативного расщепления крахмала и гликогена в полости кишечника накапливается глюкоза и другие моносахариды, которые должны попасть в кровь. Поскольку глюкоза гидрофильна, то простая диффузия через липидный бислой клеточной мембраны энтероцита для нее невозможна. Транспорт глюкозы из просвета тонкой кишки через энтероциты осуществляется с помощью белкового натрий-глюкозного транспортера (Рис.5). Этот белок имеет два центра связывания: один для натрия, другой для глюкозы и других моносахаридов. Моносахарид связывается с белком только после того, как с ним свяжется натрий. Белок-транспортер свободно мигрирует в толще мембраны. При контакте белка с цитоплазмой энтероцита натрий быстро отделяется от него по градиенту концентрации и сразу отделяется моносахарид. Результатом является накопление моносахарида в клетке, а ионы натрия выкачиваются Na+,К+-АТФазой.

Аналогичный механизм транспорта глюкозы в эпителии канальцев почек, который обеспечивает ее реабсорбцию из первичной мочи.

Рис. 5. Транспорт глюкозы через мембраны энтероцитов

Выход глюкозы из энтероцитов в межклеточное пространство и далее в кровь осуществляется при участии белка-транспортера  GluT-5. (Всего выделяют 12 типов транспортеров моносахаридов, отличающихся локализацией, сродством к моносахариду и способностью к регулированию).

После выхода в кровь, оттекающую от кишечника, глюкоза по сосудам воротной системы транспортируется в печень. Печень выполняет функцию «глюкостата»: накапливает глюкозу в виде гликогена, а при дефиците глюкозы в крови напротив, поставляет глюкозу, которая образуется за счет процессов гликогенолиза и глюконеогенеза. Необходимыми условиями активного углеводного обмена в печени является обратимый транспорт глюкозы через плазматическую мембрану гепатоцитов. Таким требованиям отвечает инсулин-независимый белок-транспортер  GluT-2, локализованный на мембране гепатоцитов, а также эпителия почечных канальцев.

В скелетных мышцах, миокарде и жировой ткани находятся GluT-4, транспортная активность которых регулируется инсулином. При действии инсулина на клетку они выходят на поверхность мембраны и переносят глюкозу внутрь.

Особенно важна глюкоза для клеток мозга. Она является основным энергетическим субстратом центральной нервной системы. Именно поэтому мозг очень чувствителен к снижению концентрации глюкозы в крови. В случае гипогликемии развивается энергетическое голодание головного мозга, и появляются такие симптомы, как слабость, повышенная утомляемость, головокружение, а в тяжелых случаях – потеря сознания и судороги.Хотя масса головного мозга составляет всего 2% от веса тела, он потребляет более половины всей глюкозы, поступившей в организм. В моменты наиболее напряжённой работы мозг может забирать до 70 - 90%, поступающих углеводов. Глюкоза транспортируется в клетки мозга инсулиннезависимым путем посредством GluT-3, который обладает высоким сродством к глюкозе, поэтому нейроны способны поглощать глюкозу даже при низких ее концентрациях в крови.Уровень глюкозы в крови поддерживается постоянным благодаря тонкой регуляции процессов ее поступления и потребления. Диапазон нормальных значений для сыворотки и плазмы натощак 3,8 - 6,1 ммоль/л, что соответствует 3,3-5,5 ммоль/л в цельной крови. Разница между сывороткой и цельной кровью обусловлена эритроцитами и лейкоцитами, в которых объем водной фазы меньше, чем в сыворотке крови, а глюкоза растворена только в водной фазе. Для клиницистов, которые зачастую не вникают в соотношения между плазмой и цельной кровью, лучше приводить значения к концентрации глюкозы в плазме венозной крови [4]. Уровень глюкозы в крови регулируется широким спектром гормонов. Единственным гормоном, снижающим глюкозу в крови, является инсулин. Контринсулярным действием, повышающим уровень глюкозы крови, обладают глюкагон, адреналин, глюкокортикоиды, соматотропный гормон (СТГ), адренокортикотропный гормон (АКТГ), тиреоидные гормоны, глюкагон. В таблице 1 представлены основные эффекты этих гормонов на метаболизм глюкозы.

Таблица 1. Гормоны, контролирующие гомеостаз глюкозы

Главным лабораторным тестом для оценки углеводного обмена считается определение уровня глюкозы в крови натощак.

1. Гипогликемия патологическое состояние, характеризующееся снижением концентрации глюкозы в крови ниже 3,5 ммоль/л.

В зависимости от выраженности симптомов гипогликемия подразделяется на следующие виды:

• Легкая степень гипогликемии – состояние, при котором человек может оказать себе первую помощь, восполнив недостаток глюкозы в крови. Первые симптомы гипогликемии проявляются при снижении уровня глюкозы в крови до 3,33—2,77 ммоль/л (60—50 мг%). 

• Гипогликемия средней степени тяжести – состояние, при котором человек не может самостоятельно оказать себе помощь, и требуется помощь других людей. Она развивается при уровне гликемии 2,77—1,66 ммоль/л (50—30 мг%) отмечаются все типичные признаки гипогликемии.

• Тяжелая стадия - гипогликемическая кома, которая требует срочной врачебной помощи. Потеря сознания обычно наступает при уровне глюкозы в крови 1,65—1,38 ммоль/л (30—25 мг%) и ниже. 

Существенное значение имеет скорость снижения гликемии. У пациентов с длительно некомпенсированным инсулинозависимым сахарнным диабетом гипогликемическая кома может развиться при нормальной или даже повышенной гликемии (11,1 ммоль/л, 200 мг% и ниже). Это происходит при быстром снижении гликемии от очень высоких уровней к более низким (например, с 22,2 ммоль/л, 400 мг% до 11,1 ммоль/л, 200 мг% и так далее). Другие лабораторные данные при гипогликемической коме неспецифичны. Глюкоза в моче, как правило, отсутствует, но у больных сахарным диабетом она может определяться, если выделилась в мочу до развития комы.

Причины развития гипогликемии

Наиболее часто гипогликемия развивается у людей, страдающих сахарным диабетом и получающих инсулин или другие препараты, снижающие концентрацию глюкозы.
Чрезмерное снижение уровня данного показателя происходит из-за несоответствия дозы препарата и исходной концентрации глюкозы в крови на момент приема лекарства. Например, если после приема назначенной дозы сахароснижающего препарата пациент съел меньше углеводсодержащихпродуктов, чем требуется, или перенапрягся физически. Чтобы предупредить развитие гипогликемии, пациентам с сахарным диабетом рекомендуется поддерживать уровень глюкозы в крови не ниже 4 ммоль/л.
 
Состояние гипогликемии может развиться и у здорового человека в случае голодания, сильного эмоционального стресса, длительной физической или умственной нагрузки без восполнения запасов глюкозы. 

Перечень заболеваний, вызывающих гипогликемию достаточно большой:

• Передозировка сахароснижающих средств у больных сахарным диабетом. 

• Заболевания кишечника и поджелудочной железы, сопровождающиеся нарушением переваривания и всасывания углеводов: инфекционный энтерит, выраженная пищевая аллергия, хронический панкреатит. Эндокринные заболевания: недостаточность выработки соматотропного гормона гипофизом, надпочечниковая недостаточность, гипотиреоз, недостаточность выработки глюкагона, врожденный гиперинсулинизм, опухоли, продуцирующие инсулин (инсулиномы).

• Заболевания почек, при которых нарушается обратный захват глюкозы из мочи в кровь (почечная глюкозурия). 

• Заболевания печени: цирроз, хронический гепатит, жировая болезнь печени. Тяжелое течение инфекционных заболеваний, при которых энергия, источником которой служит глюкоза, расходуется на борьбу с возбудителем инфекции. 

• Наследственные заболевания, в основе которых лежит нарушение обмена углеводов: гликогенозы, агликогенозы, недостаточность ферментов фруктозо-1,6-дифосфатазы, глюкозо-6-фосфатазы и др.

Клинические признаки гипогликемии:

• Повышение активности автономной нервной системы в ответ на снижение уровня глюкозы в плазме вызывает потливость, тошноту, чувство жара, тревоги и голода, дрожь, сердцебиения и парестезии.

• Недостаточное снабжение глюкозой головного мозга сопровождается головной болью, помутнением зрения или двоением в глазах, нарушением сознания, затруднением речи, судорогами и комой.

• Хроническая гипогликемия приводит к психическому изменению личности, потери памяти, психозам, деменция.

2. Гипергликемия патологическое состояние, характеризующееся повышением концентрации глюкозы в крови выше референтных значений.

Наиболее часто гипергилкемия развивается у больных сахарным диабетом.

Лабораторными критериями в диагностике сахарного диабета по уровню глюкозы крови в настоящее время считается:

• уровень глюкозы натощак 7,0 ммоль/л и выше;

• сочетание клинических симптомов СД и случайного (независимого от времени предыдущего приема пищи) повышения глюкозы плазмы крови до 11,1 ммоль/л и выше;

• уровень глюкозы через два часа после приема глюкозы (≥ 200 мг/100 мл) 11,1 ммоль/л и выше [1, 7]. 

Следует отметить, что длительная гипергликемия имеет очень серьезные последствия для организма. Поскольку глюкоза химически достаточно активное вещество, то при температуре тела она вступает в неэнзиматические реакции с целым рядом белков. Результатом является гликозилирование (гликирование) белков, которое приводит к существенному нарушению их функций.

Так, в результате такой реакции между гемоглобином А, содержащемся в эритроцитах, и глюкозой сыворотки крови образуется гликозилированный (или гликированный) гемоглобин (HbA1c). Скорость гликозилирования гемоглобина (а следовательно, его концентрация) определяется средним уровнем глюкозы, который существует на протяжении жизни эритроцита. Эритроциты, циркулирующие в крови, имеют разный возраст, поэтому для усредненной характеристики уровня связанной с ними глюкозы ориентируются на полупериод жизни эритроцитов – 60 суток. Есть, по крайней мере, три варианта гликозилированных гемоглобинов: НbA1a, HbA1b, HbA1c, но только вариант HbA1c количественно преобладает и дает более тесную корреляцию со степенью выраженности сахарного диабета [2]. Повышение концентрации глюкозы в крови значительно увеличивает ее поступление в клетки за счет инсулиннезависимых механизмов. В результате глюкоза поступает в ткани в избытке и при этом неферментативно гликозилируются следующие белки: альбумин; трансферрин; аполипопротеины; коллаген; белки эндотелия; белки хрусталика; некоторые ферменты (алкогольдегидрогеназа) и ряд других белков.

Гликозилирование – медленная реакция; в тканях здоровых людей обнаруживаются лишь небольшие количества гликозилированных белков, но у больных диабетом именно высокий уровень гликозилирования белков приводит к серьезным осложнениям. Степень гликозилирования разных белков неодинакова и в каждом случае зависит не столько от степени повышения концентрации глюкозы, сколько от времени жизни конкретного белка, т.е. от скорости его обновления. В медленно обменивающихся («долгоживущих») белках накапливается больше модифицированных аминогрупп, в короткоживущих – меньше [2]. Естественно, что при присоединении глюкозы функции белка могут нарушаться из-за изменения заряда белковой молекулы, из-за нарушения ее конформации или из-за блокирования активного центра. Это и приводит к многочисленным осложнениям диабета. От того, какие именно белки и в какой степени гликозилированы и зависит, какие именно осложнения возникнут и насколько тяжелыми они будут. Среди всех диабетических осложнений наиболее часто встречаются ретинопатии 49%; нейропатии – 40%; нефропатии – 35%, сердечно-сосудистые заболевания – 43% [14]. В данный момент для оценки рисков таких осложнений применяется измерение обобщенного показателя гипергликемии – концентрации HbA1c.

В моче здорового человека глюкоза содержится в очень низкой концентрации и при качественных и полуколичественных лабораторных исследованиях не выявляется. В норме глюкоза, как все низкомолекулярные соединения, фильтруется в клубочках почек, но затем почти полностью реабсорбируется в проксимальных канальцах. Если содержание глюкозы в крови превышает количество, которое может быть реабсорбировано в канальцах, глюкоза появляется в моче. Это происходит при превышении уровня глюкозы в крови 8,8–9,9 ммоль/л.

Наиболее частой причиной глюкозурии является сахарный диабет, тем не менее, глюкоза в моче может появляться при снижении почечного порога для глюкозы. Это, например, может быть результатом врожденной или приобретенной патологии проксимальных канальцев почек (например, синдром Фалькони), приводящий к нарушению процессов реабсорбции (почечная глюкозурия). В этом случае глюкозурия наблюдается и при нормальном уровне глюкозы в крови. Поэтому глюкозурия не может быть использована для диагностики сахарного диабета. Однако у больных с установленным диагнозом – сахарный диабет, исследование глюкозы в моче является эффективным способом наблюдения за состоянием больного и контроля эффективности лечения.

К занижению результатов измерения концентрации глюкозы может приводить присутствие в крови веществ, окисляемых перекисью водорода (например, аскорбата, билирубина, мочевой кислоты) [1].

К завышению результатов могут приводить остатки на стенках кювет экзогенной перекиси водорода. Поэтому для мытья лабораторной посуды и кювет нельзя использовать моющие и обеззараживающие растворы, содержащие перекись водорода.

1. 1. Г. Б. Алан Клиническое руководство Тица по лабораторным тестам //М.: Лабора. – 2013. 
2. 2. В.В. Вельков. Что такое гликозилированный гемоглобин? https://www.eurolab.md/library/pamyat-o-sakhare-v-krovi-glikozilirovannyjj-gemoglobin/
3. 3. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. В 2 томах. Том 1. Под ред. В.В.Долгова, В.В.Меньшикова //М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2012.
4. 4. Клиническая лабораторная диагностика. Под ред. В.В. Долгова, ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования». – М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО, 2016. – 668 с.
5. 5. Клиническая эндокринология. Руководство / Старкова Н. Т. — 3-е изд., перераб. и доп. — СПб.: Питер, 2002. - 576 с.
6. 6. Методические рекомендации «Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований крови», А.А. Кишкун и соав. Одобрены на заседании профильной комиссии Минздрава России по клинической лабораторной диагностике Москва, 30 мая 2013 г.
7. 7. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. 2-е изд., стереотипное. - М.:Медицина, 2006. – 544 с.
8. 8. Фотометрия в лабораторной практике. Долгов В. В., Ованесов Е.Н., Щетникович К.Н. //Москва. – 2004. – С. 142.
   
9. 9. Chan AY, Swaminathan R, Cockram CS. Effectiveness of sodium fluoride as a preservative of glucose in blood. Clin Chem 1989; 35:315–7.
10. 10. David B. Sacks, M. Sue Kirkman, Mark Arnold, Ake Lernmark, George L. Bakris, Boyd E. Metzger, David E. Bruns, David M. Nathan, Andrea Rita Horvath. Guidelines and Recommendations for Laboratory Analysis in the Diagnosis and Management of Diabetes Mellitus. Clin Chem. 2011 Jun;57(6): р.1-47.
11. 11. David E. Bruns, William C. Knowler. Stabilization of Glucose in Blood Samples: Why It Matters. Clin Chem. 2009 May; 55(5): 850–852.
12. 12. Leann M Mikesh, David E Bruns Stabilization of Glucose in Blood Specimens: Mechanism of Delay in Fluoride Inhibition of Glycolysis. Clinical Chemistry, Volume 54, Issue 5, 1 May 2008, Pages 930-932.
13. 13. Joanna Jung, Emily Garnett, Kesha Rector, Purviben Jariwala, Sridevi Devaraj Effect of Collection Tube Type on Glucose Stability in Whole Blood. Ann Clin Lab Sci. 2020 Jul;50(4): 557-559.
14. 14. Selvin E., Coresh J., Golden S.H., Boland L.L., Brancati F.L., Steffes M.W. Atherosclerosis risk in communities study. Glycemic control, atherosclerosis, and risk factors for cardiovascular disease in individuals with diabetes: the atherosclerosis risk in communities study//Diabetes Care. 2005. 28(8): 1965–1973.