Набор для для количественного определения содержания общего белка в сыворотке и плазме крови человека биуретовым методом "ОБЩИЙ БЕЛОК-UTS"

Принцип метода.

Белки (полипептиды) в щелочном растворе в присутствии сульфата меди (II) образуют комплексные соединения меди, окрашенные в сине-фиолетовый цвет.

Реакция протекает в 2 этапа:

На первом этапе в щелочной среде происходит денатурация белков. Их пептидные* связи из кетоформы переходят в енольную форму.

*Пептидная связь – это вид амидной связи, возникающей при образовании белков и пептидов в результате взаимодействия α-аминогруппы (—NH2) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой (—СООН) другой аминокислоты).

Затем енольная форма полипептида взаимодействует с гидроксидом меди (II) и образует окрашенный в сине-фиолетовый цвет комплекс. В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими:

Поскольку с использованием биуретового метода «прокрашиваются» пептидные связи, он позволяет определять «общую массу белка» безотносительно типа белка. В биуретовую реакцию вступают вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей, например три-, тетрапептид и т. д. Поэтому отдельные аминокислоты не дают положительную биуретовую реакцию [2].

Спектр поглощения образующегося комплекса сине-фиолетового цвета и холостой пробы представлен на Рисунке 1. Как видно из графика, максимум поглощения молекулами окрашенного комплекса расположен в диапазоне 530-570 нм и в этом диапазоне регистрируется максимальная разница в величине светопоглощения продукта реакции и холостой пробы. Поэтому для определения концентрации общего белка в образце измерение оптической плотности реакционной смеси проводится при 540 (530-570) нм (основная длина волны). Использование двухволнового фотометрирования (дифференциальная длина волны в диапазоне 640-670 нм) позволяет нивелировать влияние на результат анализа гемолиза, хилеза и иктеричности сыворотки, а также дефектов на стенках фотометрической кюветы [7].

Рис. 1. Спектры поглощения продукта биуретовой реакции и холостой пробы (данные, получены в ООО «Эйлитон» с использованием набора реагентов для количественного определения содержания общего белка в сыворотке и плазме крови человека биуретовым методом "ОБЩИЙ БЕЛОК-UTS"). Концентрация калибратора 70,0 г/л.

Для определения общего белка лучше использовать сыворотку. 

При использовании плазмы следует учитывать, что из-за вклада фибриногена в результат анализа, концентрация общего белка в плазме здоровых людей будет на 2,0 - 4,0 г/л выше, чем в сыворотке.

Исследовать можно пробы, хранящиеся при 4^оС не более 72 часов, при -20^оС до 6 месяцев или неопределенно долго при -70^оС [1].

Сыворотка крови (в плазме крови дополнительно содержится фибриноген) содержит около 1000 белков, выполняющих разнообразные функции.

Синтезируются они преимущественно в печени (основное исключение − иммуноглобулины, которые образуются в лимфоидных клетках, и гормоны белковой природы, синтезируемые в эндокринных железах), имеют разный срок циркуляции в крови и выполняют разнообразные функции.

Основные функции сывороточных белков:

• поддержание коллоидно-осмотического (онкотического) давления;

• обеспечение процесса свертывания крови;

• поддержание постоянства рН крови;

• транспортная функция – связывание и перенос липидов, билирубина, стероидных гормонов, железа и т. д.;

• участие в иммунных реакциях (иммуноглобулины, опсонины, белки острой фазы);

• поддержание баланса катионов в крови;

• функция «белкового резерва» (при голодании белки сыворотки крови утилизируются и распадаются до аминокислот, которые используются для синтеза белков жизненно важных органов).

Концентрация общего белка в сыворотке зависит, главным образом, от синтеза и распада двух основных белковых фракций – альбуминов и глобулинов.

Гипопротеинемия возникает вследствие:

• недостаточного поступления белка при длительном голодании или при продолжительном соблюдении безбелковой диеты;

• повышенной потери белка при различных заболеваниях почек, кровопотерях, ожогах, новообразованиях, сахарном диабете, асците;

• нарушения образования белка в организме при недостаточности функции печени (гепатиты, циррозы, токсические повреждения), длительном лечении кортикостероидами, обладающими катаболическим действием; нарушения всасывания (при энтеритах, энтероколитах, панкреатитах);

• усиления процессов распада белка при лихорадочных состояниях и интоксикациях;

• сочетания различных из перечисленных выше факторов.

Снижение уровня общего белка в сыворотке крови ниже 50 г/л часто сопровождается гипопротеинемическими отеками тканей

Гиперпротеинемия встречается сравнительно редко. Кратковременное повышение концентрации общего белка в сыворотке крови нередко развивается как следствие дегидратации в результате потери части внутрисосудистой жидкости. Это происходит при тяжелых травмах, обширных ожогах, холере. При острых инфекциях содержание общего белка часто повышается вследствие возрастания синтеза белков острой фазы.

При хронических инфекциях содержание общего белка в крови может нарастать в результате активации иммунологического процесса и повышенного образования иммуноглобулинов. Стойкая ярко выраженная гиперпротеинемия наблюдается при появлении в крови парапротеинов - патологических белков, вырабатываемых в большом количестве при миеломной болезни и при болезни Вальденстрема. Концентрация общего белка в сыворотке при данных заболеваниях может достигать значений 120 г/л и выше. Умеренная гиперпротеинемия встречается иногда в стадии выздоровления от острых вирусных гепатитов.

При взятии проб крови для исследования на величину общей концентрации белка могут оказывать влияние положение тела, длительность наложения жгута при взятии крови и физическая активность. Активная физическая работа и смена положения тела с горизонтального на вертикальное повышает содержание белка в сыворотке крови на 10%.

При оценке результатов определения общего белка в сыворотке важно понимать, что степень выраженности гипо- и гиперпротеинемии должна служить не только в качестве диагностического признака при определении природы болезни, но прежде всего показателем тяжести заболевания, позволяющим следить за динамикой патологического процесса, определяющим в ряде случаев тактику лечения и, в частности, способы снабжения организма больного необходимыми количествами белка [3, 4, 5].

Для исследования не следует использовать гемолизированную сыворотку, так как, поскольку гемоглобин также является белком, он будет вступать в биуретовую реакцию, что приведет к ложному завышению результатов анализа. Присутствие гемоглобина в образцах сыворотки/плазмы приводит к завышению результатов на 3 % на каждый 1 г/л свободного гемоглобина в сыворотке.

Ложное завышение результатов будет регистрироваться в хилезной сыворотке за счет оптической интерференции с результатами определения. Для устранения интерференции, вызванной значительной липемией применяют экстракцию диэтиловым эфиром. При незначительном присутствии липидов можно провести исследование, установив "бланк" по пробе больного, либо развести пробу изотоническим раствором хлорида натрия, а затем умножить результат на степень разведения. Самое лучше решение - использовать бихроматический режим измерения.

Интерферирующее действие оказывает и билирубин при концентрации более 85 мкмоль/л. Поэтому в случае гипербилирубинемии также используют либо разведение сыворотки, либо установку «бланка» по пробе больного.

В ряде случаев на результат анализа влияют препараты, применяющиеся для лечения пациентов. Так, например, декстраны, используемые в качестве плазмозамещающих растворов, образуют комплекс с медью и тартратом в реакционной смеси, что приводит к образованию рыхлого синего осадка. Степень интерференции зависит от концентрации декстрана.

1. 1. Алан Г. Б. Клиническое руководство Тица по лабораторным тестам //М.: Лабора. – 2013. – Т. 1280.
2. 2. Биохимия. Практикум : Учебное пособие по курсу «Медицинская биохимия»/Л. А. Ганеева, Л. И. Зайнуллин, З.И. Абрамова, Н. Х. Тенишева. — Казань : ИСБ, 2015. — 176 с.
3. 3. Клиническая лабораторная диагностика. Национальное руководство. В 2 томах. Том 1. Под ред. В.В.Долгова, В.В.Меньшикова //М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2012.
4. 4. Клиническая лабораторная диагностика. Под ред. В.В. Долгова, ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования». – М.: ФГБОУ ДПО РМАНПО, 2016. – 668 с.
5. 5. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований./Назаренко Г.И., Кишкун А.А. 2-е изд., стереотипное. - М.:Медицина, 2006. – 544 с.
6. 6. Методические рекомендации «Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований крови», А.А. Кишкун и соав. Одобрены на заседании профильной комиссии Минздрава России по клинической лабораторной диагностике Москва, 30 мая 2013 г.
7. 7. Фотометрия в лабораторной практике. Долгов В. В., Ованесов Е.Н., Щетникович К.Н. //Москва. – 2004. – С. 142.