Системы взятия крови:

06.04.2022

Особенности преаналитического этапа при коагулологических исследованиях

Вакуумные пробирки с цитратом натрия используются для исследования плазменного и тромбоцитарного звена системы гемостаза. Цитрат натрия – единственный антикоагулянт, который удовлетворяет всем требованиям к стабилизации пробы для выполнения этого вида  исследований.  Цитрат натрия останавливает реакции свертывания крови, связывая ионы кальция, при этом, в отличие от других антикоагулянтов, в частности, ЭДТА и гепарина, не вызывает изменений в иных звеньях системы гемостаза.  

Концентрация цитрата натрия

ВАЖНО! В вакуумных системах для взятия крови применяют раствор цитрата натрия в концентрации 109 ммоль/л (0,109 М) или 129 ммоль/л (0,129 М), что соответствует 3,2% и 3,8% 2-водного трехзамещенного цитрата натрия. При выборе пробирок с цитратом натрия следует обращать внимание не на процентную концентрацию цитрата, а на его молярную концентрацию!

В настоящее время, в соответствии с рекомендациями Института Клинических Лабораторных Стандартов (CLSI), предпочтительным является применение пробирок с концентрацией цитрата натрия 3,2% (109 ммоль/л)!

«Правильная» молярность цитрата натрия принципиально важна в Ca-зависимых тестах! Это наиболее часто выполняемые тесты для диагностики плазменного звена системы гемостаза, в частности ПВ и АЧТВ. Все контрольные материалы и калибраторы, которые предназначены для работы с Ca - зависимыми тестами, произведены на основе концентрации цитрата 109 ммоль/л. И если кровь пациента берется в пробирку с концентрацией цитрата 3,8% (129 ммоль/л), то такой образец содержит больше цитрата, чем контрольный материал, с которым его будут сравнивать. Соответственно, количество Ca²⁺, который будет нейтрализовываться цитратом, прежде чем вступить в реакцию и запустить свертывание, будет больше. А, поскольку кальция в тесте (плазме пациента) и контрольной плазме добавляется одно и то же количество, соответственно, на тест его останется меньше, и это приведет к удлинению ПВ и АЧТВ.  

Согласно требованиям ВОЗ, во избежание существенных диагностических ошибок при определении Международного Нормализованного Отношения (МНО), для теста протромбинового времени следует использовать 0,109 М (109 ммоль/л) раствор трехзамещенного цитрата натрия в соотношении кровь: антикоагулянт = 9:1. Другие международные источники также рекомендуют использовать в тесте ПВ раствор трехзамещенного цитрата натрия в концентрации (109 ммоль/л). Раствор цитрата натрия с концентрацией 129 ммоль/л (3,8%) не должен быть использован в данном тесте*.

Пробирки с цитратом натрия в концентрации 3,8% (129 ммоль/л) используются для исследования тромбоцитарного звена системы гемостаза.

*Информация получена с сайта компании НПО Ренам – крупнейшего российского производителя наборов реагентов для оценки системы гемостаза: http://www.renam.ru/citrat-natriya-vybor-koncentracii-3-2-ili-3-8

Соотношение кровь:антикоагулянт

Важным моментом на преаналитическом этапе коагулологических исследований является четкое соблюдение соотношения кровь:антикоагулянт 9:1. Взятие меньшего количества крови, чем определено ее номинальным объемом, (т. е., недостаточное заполнение пробирки), изменяет соотношение плазмы к антикоагулянту, что, в свою очередь, изменяет коэффициент разведения белков плазмы, а относительный избыток цитрата может нарушить процессы рекальцификации и активации свертывания крови. Если пробирка для взятия крови содержит от 80% до 90% целевого объема заполнения, возможно незначительное артефактное удлинение ПВ и АЧТВ. Однако, если пробирки заполнена кровью менее чем на 80% от ее номинального объема заполнения, ПВ и АЧТВ будут ложно завышены даже у здоровых пациентов, а влияние на другие тесты коагуляции может быть смещенным непредсказуемо. Ложное завышение ПВ и АЧТВ в недостаточно заполненных пробирках более выражено при концентрации цитрата 3,8% в сравнении с 3,2%. Поэтому Международный совет по стандартизации в гематологии (ICSH) категорически не рекомендует анализировать образцы крови пациента из пробирок, заполненных менее, чем на 80% от номинального объема.

Вероятность того, что объем крови может быть больше номинального  менее вероятна, поскольку объем вакуума в пробирках четко дозирован и сила аспирации не позволяет избытку крови попасть в пробирку.

Влияние гематокрита

Так как весь связываемый цитратом кальций находится в плазме, то весьма важным при фиксированном соотношении объемов цельная кровь/антикоагулянт 9:1 является учет величины гематокрита в полученном образце крови. При высоком гематокрите (более 55%) возможна «передозировка» пробы раствором цитрата натрия (особенно 3,8% цитратом), что при ее дальнейшем анализе вызовет ложное удлинение значений протромбинового времени и АЧТВ. По сути, в таких образцах соотношение антикоагулянта к плазме изменено так же, как и в недостаточно заполненных образцах. 

Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI)  Всемирная федерация гемофилии акцентируют внимание на необходимости корректировки соотношения цитрат / кровь при гематокрите> 55%. Для этого рекомендовано использовать формулу:

   

где C - объем цитрата в миллилитрах (мл), который следует добавить к объему крови (V) в мл для образования образца крови с антикоагулянтом. 

 Пример: Для Hct 70% при объеме взятия крови 4,5 мл перед добавлением антикоагулянта, получается следующий результат: 

 

то есть, 0,25 мл цитрата необходимо смешивают с 4,5 мл крови.

Если у пациента тяжелая анемия, объем плазмы увеличивается, так что после смешивания с тринатрий цитратом в пробирке может быть достаточно остаточного кальция для продолжения коагуляции в образце, что приводит к активации и возможному сокращению АЧТВ наряду с потреблением факторов свертывания крови, в том числе фибриногена. Однако низкий гематокрит в меньшей степени влияет на результаты, поэтому обычно нет необходимости корректировать соотношение цитрата к крови для образцов, взятых у пациентов с анемией.  

Последовательность взятия образцов крови

При взятии крови для выполнения гемостазиологических тестов очень важно во время венепункции не допустить попадания в пробирку с цитратом частичек поврежденных тканей, а также других антикоагулянтов.  Это важно, поскольку даже минимальное количество тромбина, который образуется при активации свертывания, резко ускоряет ферментные реакции гемостаза, что ведет к ложному укорочению времени основных скрининговых тестов – АЧТВ и ПВ и искажению других параметров. А попадание в пробу крови других антикоагулянтов может частично заблокировать определенные звенья системы гемостаза и тоже оказать значительное влияние на результаты анализа. В связи с этим, Международный совет по стандартизации в гематологии (ICSH) рекомендует использовать следующую последовательность взятия образцов крови:

1. Пробирка без наполнителя

2. Пробирка с цитратом натрия

3. Пробирка для сыворотки с активаторами свертывания или без них, с гелем или без него

4. Пробирки с гепарином с гелем или без него

5. Пробирки с ЭДТА

6. Пробирки с ингибитором глюкозы

7. Другие пробирки

Если кровь берется только на гемостаз, сначала необходимо взять кровь в пустую пробирку, затем в пробирку с цитратом.

В соответствии с рекомендациями Института Клинических Лабораторных Стандартов (CLSI) после взятия крови в пробирку с цитратом, необходимо, осторожно переворачивая пробирку, проверить полученный образец на предмет образования сгустков. При выявлении сгустков, образец, естественно, отбраковывается.

Сразу после взятия крови в пробирку с раствором цитрата необходимо осторожно перемешать содержимое, переворачивая пробирку 3–4 раза.

Условия центрифугирования 

• Плазма, обогащенная тромбоцитами – 5 - 7 мин. при 150 - 200 g. Эта плазма используется только для выполнения функциональных тестов тромбоцитов (агрегации, адгезии, трансформации). Оптимальным вариантом является отдельная пробирка с цитратом для этих исследований. Одна часть обогащенной плазмы отбирается для выполнения тестов, а вторая повторно центрифугируется для получения бедной тромбоцитами плазмы, которая является контролем для данных тестов.
• Плазма, бедная тромбоцитами (концентрация тромбоцитов < 10 000 /мкл) - 10 - 15 мин. при 1 500 - 2 000 g. Эта плазма является основным материалом для выполнения большинства гемостазиологических исследований: скрининговых тестов коагуляции и фибринолиза, а также для определения факторов, маркеров и ингибиторов различных звеньев свертывающей системы.
• Плазма, свободная от тромбоцитов (концентрация тромбоцитов < 1 000 /мкл) – 20 - 30 мин. при 2 000 - 3 000 g. Этот вид материала оптимален для выполнения тестов, на результаты которых могут повлиять как сами тромбоциты, так и секретируемые ими биологически активные вещества, например, тромбоцитарные факторы 3 и 4, протеин S. К таким тестам, в частности, относятся тесты на антифосфолипидные антитела, включая волчаночный антикоагулянт. Плазма, свободная от тромбоцитов также используется для случаев, когда материал требуется заморозить из-за невозможности его быстрого исследования, так как замораживание вызывает повреждение тромбоцитов и выброс их факторов в пробу с соответствующим изменением результатов тестов.

Надежность процедуры центрифугирования следует проверять каждые шесть месяцев или после ремонта центрифуги, чтобы убедиться в том, что количество тромбоцитов в плазме находится в допустимых пределах.

Транспортировка и хранение проб

Допустимый интервал времени между взятием образца и его исследованием зависит от температуры, при которой образец транспортируется и хранится.

 В соответствии с рекомендациями Института Клинических Лабораторных Стандартов (CLSI) образцы, предназначенные для исследования показателей гемостаза следует обрабатывать и хранить следующим образом: 

• Образцы для определения ПВ, не центрифугированные или центрифугированные с плазмой, оставшейся поверх клеток, в закрытой пробирке необходимо хранить при температуре от +18 до +24°C. Они должны быть протестированы в течение 24 часов с момента сбора образца. Хранение при температуре от +2 до +4 °C может привести к холодовой активации фактора VII и, следовательно, повлиять на результаты ПВ. Если пациент находится на терапии гепарином или на пероральной антикоагулянтной терапии препаратами на основе кумарина, ПВ может изменяться в зависимости от времени хранения образца, если только в состав используемого набора реагентов не входит нейтрализатор гепарина. 

• Образцы для рутинных анализов АЧТВ у пациентов (которые не находятся на терапии гепарином), не центрифугированные или центрифугированные с плазмой, оставшейся поверх клеток в закрытой пробирке, необходимо хранить при температуре от +2 до +4°C или от +18 до +24°C. Они должны быть протестированы в течение четырех часов с момента сбора образца. 

• Образцы для анализа АЧТВ, предположительно содержащие нефракционированный гепарин, хранят при температуре от +2 до +4°C или от +18 до +24°C. Их следует центрифугировать в течение одного часа после взятия, а плазму протестировать в течение четырех часов с момента сбора образца. Если планируется транспортировка пробы для исследования, например, в централизованную лабораторию, то во избежание перемешивания отцентрифугированного образа, необходимо после центрифугирования плазму удалить и провести исследование в течение четырех часов. 

• Образцы для других анализов (например, тромбиновое время, протеин С, фактор V и фактор VIII) необходимо хранить при температуре от +2 до +4°C или от +18 до +24°C. Они должны быть отцентрифугированы и протестированы в течение четырех часов с момента взятия образца. 

• Если невозможно провести определение ПВ в течение 24 часов и АЧТВ и других показателей плазменного звена системы гемостаза в течение 4 часов, плазму следует заморозить. Она может храниться при температуре - 20°C до двух недель или при -70°C - до шести месяцев. Замороженные образцы плазмы следует быстро размораживать при температуре 37°C при осторожном перемешивании. После размораживания их следует анализировать немедленно, или, если это невозможно, допустимо проведение исследования в течение двух часов, но при этом образец до проведения исследования должен храниться при температуре +4°C. Следует учитывать, что замораживание плазмы может повлиять на результат определения АЧТВ.  

Список литературы:

1. Kitchen S, Adcock DM, Dauer R, et al. International Council for Standardisation in Haematology (ICSH) recommendations for collection of blood samples for coagulation testing. Int J Lab Hematol. 2021;43:571–580.

2. NCCLS. Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays; Approved Guideline—Fourth Edition. NCCLS document H21-A4 (ISBN 1-56238-521-6). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.

3. Вавилова Т.В., Гильманов А.Ж., Мамаев А.Н. Коагулологические исследования. - Клиническая лабораторная диагностика. Национальное Руководство: в 2 т. -Том 1 / под ред. В.В.Долгова, В.В.Меньшикова. –М., ГЭОТАР-Медиа, 2012. –С.749-815.

4. Влияние концентрации цитрата натрия на результаты коагулологических исследований. http://www.renam.ru/citrat-natriya-vybor-koncentracii-3-2-ili-3-8

5. Крюкова В. А. Современные представления о преаналитике коагулологических исследований. Тромбоз, гемостаз и реология, №3 (27), октябрь 2006 г.

6. Преаналитический этап в гемостазиологии / А.А.Козлов, А.Л.Берковский, Е.В.Сергеева, А.В.Суворов – М.: Принт. 2013. – 48 с.