Коагулология:

21.05.2009

Оптимальные подходы к построению лаборатории гемостаза

Шибанов А.Н. –  Генеральный директор А/О Юнимед

 

При подготовке данной статьи были использованы материалы, любезно предоставленные нам заведующим лабораторией гемостаза при ЦНИЛ Алтайского государственного университета д.м.н., профессором А.П. Момотом

 

За последние десятилетие количество семинаров и конференций, посвященных вопросам диагностики и коррекции системы гемостаза, заметно возросло. Это, очевидно, отражает серьезные изменения в оценке клиницистами роли системы гемостаза в патогенезе различных заболеваний. Особая значимость контроля свертывающей системы крови в последнее время связана с активным применением в клинической практике современных высокоэффективных антикоагулянтов прямого и непрямого действия, антиагрегантов и тромболитиков. Узкий терапевтический коридор и избирательная индивидуальная чувствительность к препаратам разных групп требует точного индивидуального подбора дозировки и продолжительности лечения, а главное целесообразности и эффективности проводимой терапии. Более того, большое количество людей имеют определенные факторы риска, обусловленные генетическими дефектами отдельных звеньев гемостаза, применением некоторых фармакологических препаратов, в том числе антибиотиков и оральных контрацептивов, наличием сопутствующих заболеваний. В обычных условиях дисбаланс компонентов свертывающей системы может не проявиться, но в условиях оперативного вмешательства или бесконтрольно назначенной терапии риск тяжелых осложнений у таких пациентов многократно возрастает. В тоже время, выявление этих факторов риска у разных групп пациентов и принятие соответствующих профилактических мероприятий позволяет избежать тяжелых осложнений.

Современные методы лабораторной диагностики состояния системы гемостаза позволяют получить большой объем информации. Однако, чтобы эта информация имела высокую диагностическую значимость, лаборатория гемостаза должна отвечать целому ряду жестких требований.

Нередко возникает так называемый порочный круг. Из-за недостаточного финансирования, выделяемого на лабораторную диагностику гемостаза, лаборатория не может обеспечить высокое качество исследований. Лаборатория пользуется устаревшими методиками и самостоятельно приготовленными неаттестованными реагентами и контрольными материалами, спектр исследований не выходит за рамки 3-4 скрининговых тестов, сами исследования проводятся ручными методами с использованием морально и физически устаревшего оборудования. Кроме этого, нередко в ЛПУ неправильно организован этап получения и транспортировки исследуемых образцов, и, наконец, отсутствуют специалисты – врачи-патологи, дающие квалифицированное заключение о проведенных исследованиях и интерпретацию полученных результатов для лечащего врача.

Все это приводит к тому, что клиницист не может полностью полагаться на результаты лабораторных тестов, так как они низко информативны. Такая лаборатория вносит очень малый вклад в эффективность лечебно-диагностического процесса, и, как следствие, в ЛПУ все меньше средств выделяется на ее оснащение.

Чтобы разорвать этот порочный круг необходимо как специалистам лабораторной диагностики, так и врачам-клиницистам хорошо знать те возможности, которые имеются сегодня в распоряжении современной КДЛ, диагностическую значимость отдельных лабораторных тестов и проводить целенаправленное обследование пациента в соответствии с разработанными схемами для каждого клинического состояния.

 

 

Каковы же основные правила организации современной лаборатории гемостаза?

 

Первый этап-направление на исследование.  

Исследование гемостаза, как и любых других аналитических параметров, исходит от направления лечащего врача. Несомненно, что поиск нарушений в свертывающей системе крови необходимо назначать для решения конкретных задач диагностики, при наличии конкретных показаний, а не для механического выполнения любому больному 2-3 дежурных тестов ("тромбоциты, ПТИ, фибриноген").

Диагностически значимыми предпосылками для исследования гемостаза являются:

• определение причины кровоточивости;
• распознавание причин склонности к тромбофилии;
• отбор больных группы риска для профилактики тромбоэмболий и кровотечений в послеоперационном (послеродовом) периоде;
• диагностика ДВС-синдрома при неотложных и критических состояниях;
• контроль за лечением антикоагулянтами, антиагрегантами, фибринолитиками, и препаратами заместительной терапии компонентами крови.

Правильный выбор набора тестов, который должна выполнить лаборатория решающим образом определяет эффективность диагностики. Определение только времени кровотечения и так называемого "протромбина и фибриногена" в составе коагулограммы у всех без разбора больных совершенно неадекватно задачам лабораторной диагностики. И даже если эти анализы выполняются качественно, качество диагностики нарушений гемостаза в целом в данной конкретной лаборатории можно считать низким.

Современные схемы и способы лабораторной диагностики патологии гемостаза включают в себя:

• оценку сосудисто-тромбоцитарного гемостаза (агрегометрия плазмы)
• оценку коагуляционного гемостаза (коагуляционные, иммуноферментные методы определения аномалий или дефицита факторов свертывания);
• определение основных физиологических антикоагулянтов (антитром­бина III, компонентов системы протеина С);
• определение нарушений системы фибринолиза (дефицита или аномалии плазминогена, a₂-антиплазмина, тканевого активатора плазминогена и др.);
• выявление маркеров активации внутрисосудистого свертывания крови и активации фибринолиза (РФМК или растворимого фибрина, D-димера и др.).

Важное значение имеет также адекватная подготовка больного к даче крови на исследование и учет влияния медикаментов на показатели коагулограммы. Чаще всего, на результатах анализов сказывается гепаринотерапия, прежде всего обычным гепарином (низкомолекулярные гепарины мало влияют на показатели свертывания крови), прием антиагрегантов, активаторов фибринолиза и заместительная терапия компонентами крови и кровезаменителями (в последнем случае приводящая к гиперцитратемии и/или гемодилюции).

Для качественной диагностики и достоверности заключения достаточное внимание должно быть уделено правильному заполнению направления на обследование. Кроме обычных граф (Ф.И.О., возраст и др.) оно должно включать:

• время взятия крови для исследования;
• клинический диагноз (или ситуация), цель обследования;
• указание о наличии геморрагических (носовых, маточных и др. кровотечений) и/или тромботических проявлений, шока, полиорганной недостаточности, травмы (ожоговой и др.);
• информацию о проводимом лечении, способном оказать влияние на параметры гемостаза (аспирин и другие антиагреганты, антикоагулянты, тромболитики, ингибиторы фибринолиза, гормональные контрацептивы, декстраны, полиглюкины, гемо - и плазмотрансфузии и др.), их дозировка, способ и сроки последнего введения.

 

Второй этап – преаналитический (получение крови, ее стабилизация и выделение образцов плазмы).

Этот этап имеет критическую значимость для обеспечения качества исследований, поскольку именно здесь допускается более 80% ошибок.

 

1. Выбор лабораторной посуды и ее правильная обработка

Известно, что отрицательно-заряженная поверхность стекла активирует процесс свертывания крови.  Ранее для исследования гемостаза стеклянную посуду приходилось обрабатывать специальным веществом - силиконом. Однако процедура силиконирования очень трудоемкая и требует работы под вытяжкой. Поэтому в последнее время широкое распространение получили пластиковые пробирки (например, робирки для коагулологии с 3,8% цитратом натрия Vacuette) и автоматические пипетки. Им следует отдавать предпочтение, поскольку они не нуждаются в силиконировании, лучше калиброваны и легко маркируются.

 

2. Техника взятия крови и способ ее получения

Лабораторная диагностика нарушений гемостаза весьма чувствительна к соблюдению известных правил взятия, хранения и подготовки крови для исследования. Неверное соотношение крови с раствором 3,8% цитрата натрия, недостаточное их смешивание, длительный временной промежуток от венепункции до исследования и ряд других причин неизбежно ведут к "внутрипробирочному" свертыванию крови или, при передозировке антикоагулянта, к ложной гипокоагуляции. Следовательно, принципиально важен также «входной» контроль крови перед проведением ее исследования. Этот контроль должен включать в себя:

• проверку маркировки пробы с обязательным указанием времени забора крови;
• контроль достаточности полученного объема крови по метке на пробирке, соответствие стабилизатора гематокриту;
• контроль на возможное спонтанное свертывание крови, который проводят медленно наклоняя пробирку в горизонтальной плоскости. Стабилизированная кровь не должна иметь сгустков и плотных образований.

 

3. Центрифугирование

Соблюдение режима центрифугирования особенно критично для диагностики нарушений тромбоцитарного гемостаза (исследование богатой тромбоцитами плазмы), фибринолиза и выполнения фосфолипид-чувствительных тестов (исследование бедной тромбоцитами плазмы), например, для выявления волчаночного антикоагулянта при диагностике антифосфолипидного синдрома.

Богатую тромбоцитами плазму получают центрифугированием при 140-160g в течение 5-7 мин.

Бедную тромбоцитами плазму получают повторным центрифугированием при 1200-1400g в течение 15 мин.

Частоту вращения (f) необходимо рассчитать с учетом радиуса ротора центрифуги, указанного в паспорте прибора по формуле:

'

где  f - частота вращения (обороты/мин),

       g - эффективное ускорение,

       R – радиус ротора центрифуги в см.

 

Третий этап – собственно аналитический

На этом этапе важную роль играют: выбор аналитических методов, качество используемого оборудования и реагентов. Одной из основных причин низкого качества проводимых исследований часто является применение устаревших, мало точных методик (время рекальцификации, b-нафтолового теста, аутокоагуляционного теста и др.). Определение концентрации фибриногена, например, основывается в большинстве лабораторий на весовом методе Рутберг, низкая надежность которого известна. В современной лаборатории для выполнения этого исследования следует применять метод Клаусса, с применением современного коагулометра (например, Минилаб 701). Встречается также неоднозначная оценка результатов отдельных методов коагулограммы. К примеру, результаты протромбинового теста выражают сегодня в четырех вариантах, что мало способствует стандартизации этой базовой методики. Совершенно непонятна приверженность клиницистов и врачей-лаборантов к оценке протромбинового теста в % протромбинового индекса, несмотря на обширную литературу о неточности и неприемлемости такой оценки, скрывающей качество применяемого тромбопластина. Во всем мире принято выражать результаты этого теста в % по Квику (по калибровке, построенной на разведениях контрольной нормальной плазмы) и в МНО (международном нормализованном отношении), используемом в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1983) при контроле за применением антикоагулянтов непрямого действия (АНД). Это не только необходимые элементы стандартизации, но и возможность реально снизить число геморрагических осложнений от передозировки АНД.

Ниже мы приводим краткий обзор современных методов для исследований показателей системы гемостаза и применяемого для этого оборудования.

 

Клоттинговые методы исследования плазменного гемостаза

Это самые широко используемые методы при диагностике свертывающей системы крови. Методы основаны на регистрации времени образования фибринового сгустка. В зависимости от присутствия в реакционной пробе тех или иных активаторов или ингибиторов, добавляемых при проведении исследования, можно оценивать активность отдельных звеньев или путей плазменного гемостаза. Клоттинговые методы позволяют выполнять исследования протромбинового теста (протромбиновое отношение, по Квику, МНО), определение концентрации фибриногена, АЧТВ, тромбинового теста, антитромбина III, определение аквтивности VIII и IX факторов свертивающей системы, определение волчаночного антикоагулянта и др.

Производство стандартизованных готовых форм реагентов и контрольных материалов, а также применение коагулометров сделало клоттинговые исследования быстрыми, точными, воспроизводимыми и, следовательно, информативными для клиники.

Более того, стали доступными новые современные методики, основанные на использовании малых количеств биологических жидкостей и исследовании непосредственно капиллярной цельной крови, что сейчас очень актуально и для детских отделений, и для пациентов, подвергающихся постоянному мониторингу свертывающей системы. Поэтому применение коагулометра не просто повышает правильность и воспроизводимость коагулологических исследований, но в большой степени расширяет диагностические возможности лаборатории.

Учитывая разнообразие клоттинговых тестов, к коагулометру предъявляются определенные требования:

• Достаточная чувствительность при работе с сильно разведенными плазмами, и плазмами с низким содержанием фибриногена(для определения активности антитромбина III, факторов VIII и IX, концентрации фибриногена по Клауссу, диагностике нарушений в системе протеина С и др.).
• Возможность проводить исследования, как на плазме, так и на цельной крови(для протромбинового времени и расчета МНО, при условии использования правильной методики забора капиллярной крови и применения реагентов, специально разработанных для исследования капиллярной крови (например Технология Стандарт Техпластин К, МИЧ 1,1; 1,2).
• Способность работать с реагентами разных производителей.

Всем этим требованиям удовлетворяют оптико-механические двух- и четырехканальные  коагулометры Минилаб 701 и Минилаб 704 (Россия). Это программируемые приборы. На них можно выполнять все клоттинговые тесты, выбрав оптический или механический режим регистрации момента коагуляции, задавать нужное время прогрева плазмы, получать результат в конечных единицах теста. Измерение начинается автоматически, после внесения реагентов обычной пипеткой.

 

Когулометры Минилаб - рекомендованы для широкого использования в КДЛ специалистами кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО (зав. каф. проф. Долгов В.В.) и включены в перечень импортозамещающей продукции, рекомендованой для российских лабораторий.

 

 Исследование агрегации тромбоцитов

Диагностика функционального состояния тромбоцитов, а также содержание фактора Виллебранда в плазме осуществляется на агрегометре. Без исследований агрегации тромбоцитов невозможно обойтись при диагностике нарушений тромбоцитарного гемостаза и геморрагической мезенхимальной дисплазии, диагностике тромбозов, тромбоэмболий и ДВС–синдрома, идентификации гематогенных тромбофилий, дифференциальной диагностике нарушений в системе протеина С, диагностике гиперкоагуляционного синдрома (синдрома вязких тромбоцитов), контроле за лечением антиагрегантами. Причем, в ряде случаев необходимо оценить спонтанную агрегацию и агрегацию малыми дозами индуктора. Не каждый агрегометр позволяет это сделать.

Хорошо известный анализатор агрегации тромбоцитов АЛАТ 2-"Биола" благодаря сочетанию традиционного метода Борна с уникальным лазерным методом регистрации агрегации позволяет исследовать как спонтанную агрегацию тромбоцитов, так и индуцированную разными видами индукторов в широком диапазоне концентраций. С помощью агрегометра Биола LA230 можно также подсчитывать количество тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме, это особенно актуально, если нет автоматического гематологического анализатора. С помощью агрегометра Биола LA230 выполняется исследование плазмы на наличие фактора Виллебранда.

 

Методы с хромогенными субстратами

Ряд факторов свертывающей и противосвертывающей систем гемостаза являются ферментами. Очевидно, что эти факторы можно исследовать по их ферментативной активности. Для этого нужно к конкретному фактору подобрать такой субстрат, чтобы в результате ферментативной реакции образовалось вещество хорошо поглощающее свет в видимой области спектра. По скорости образования этого вещества можно судить о ферментативной активности фактора. На этом принципе основаны методы определения активности антитромбина III, факторов VIII и IX, определение плазминогена и a₂-антиплазмина

Для методов с хромогенными субстратами разработаны специальные наборы, с указанием методики определения.

Эту задачу успешно решает биохимические анализаторы. .

 

 Количественная оценка форменных элементов крови

Для оценки системы гемостаза представляет наибольший интерес значение концентрации тромбоцитов в крови пациента. К сожалению, как раз именно этот показатель ручными методами определяется наименее точно. Не вызывает сомнения, что любая лаборатория сегодня должна отказаться от ручного подсчета клеток крови. Определение этих показателей с помощью гематологического анализатора не только экономит во много раз время на исследование и обеспечивает получение точных результатов. Гематологические анализаторы открывают путь к получению совершенно новых диагностических данных.

В большинстве ЛПУ исследование концентрации форменных элементов крови выполняется в клинической лаборатории. Тем не менее важно, чтобы результаты исследований передавались в лабораторию гемостаза, учитывались при анализе общей картины состояния системы гемостаза больного и включались в ответ лаборатории гемостаза наряду с результатами собственных исследований.

 

Иммуноферментный анализ

Большинство факторов свертывающей и противосвертывающей систем являются белковыми соединениями, к которым могут быть получены антитела и, соответственно, созданы ИФА-наборы. Иммуноферментный метод позволяет определять концентрацию некоторых факторов системы гемостаза, например, антитробина III, содержание в крови продуктов, образующихся в результате функционирования этих факторов, в частности, продуктов деградации фибриногена и Д-димеров, определение антител к кардиолипину и фосфатидилсерину при диагностике антифосфолипидного синдрома и др.

Использование методов ИФА предполагает оснащение лаборатории иммуноферментным фотометром, инкубатором-встряхивателем, промывающим устройством и дозаторами для ИФА.

Группа компаний Юнимед предлагает как полную комплектацию ИФА лаборатории, так и отдельные приборы.

 

ИФА лаборатория организационно может быть как самостоятельным подразделением КДЛ, так и входить в состав лаборатории гемостаза. Последнее целесообразно, если объем выполнения ИФА исследований показателей гемостаза достаточно большой.

 

ДНК диагностика методом ПЦР

Ряд нарушений в системе гемостаза обусловлены дефектами генов, кодирующих факторы свертывающей системы крови. Для диагностики этих нарушений следует применять методы полимеразной цепной реакции.

Данные исследования очень важны и являются ключевыми при диагностике тромбофилий, которые протекают без значительных нарушений функции тех или иных звеньев системы гемостаза, например при аномалиях протромбина и факторов VII и VIII. Они важны также для разграничения генетически обусловленных и вторичных (симптоматических) форм этой патологии, в частности, наследственной и приобретенной резистентности к активированному протеину С.

 

Четвертый этап – постаналитический

Результаты всего обследования используются для оценки про- и антикоагулянтного баланса крови, оценки степени опасности различных осложнений, прогноза дальнейшего течения выявленной патологии и выбора наиболее адекватных индивидуализированных методов лечения. Поэтому все результаты, полученные как в самой лаборатории гемостаза, так и в других отделах КДЛ, заносятся в протокол динамического обследования, который потом прилагается к истории болезни. По каждому исследованию врач-патолог лаборатории гемостаза должен составить заключение, в котором он трактует данные для лечащего врача: характеризует выявленные нарушения, выявляет преобладающую тенденцию, оценивает изменения лабораторных показателей, в т.ч. с точки зрения возможной патологии, компенсации или индивидуальной нормы, а также оценивает эффект проводимой терапии.

Для эффективной работы врача-патолога лаборатории гемостаза полезно применять компьютерные базы данных, в которых хранятся результаты исследований пациентов, информация о проводимом лечении. Возможность представления информации в виде графиков изменений тех или иных показателей гемостаза облегчает анализ и повышает достоверность оценки состояния гемостаза.